SpectraMax M5e多功能微孔板读板机具 有双单色器，能够进行荧光、时间分辨荧 光(TRF)、荧光偏振、光吸收和化学发光 检测。它具有HTRF(均相时间分辨荧光) 认证的优势，使得生命科学和药物发现研 究者们通过TRF检测的高度灵活性提高产 出。 HTRF是Cisbio Bioassays公司开发的一 项检测生物分子相互作用的多用途技术 1。此技术结合了荧光共振能量转移 (FRET)和TRF的特点，采用铕(Eu)的穴状 化合物作为供体荧光基团和一种经过修饰 的别藻蓝蛋白(XL665)或小分子d2作为受 体荧光基团。当标记了铕穴状化合物和d2 的生物分子相互作用时，FRET就会在供体 和受体荧光基团间发生，可在665nm处检 测到荧光发射，此时大部分穴状化合物的 激发能量都以620nm荧光发射释放出来。 孔与孔之间的差异通过利用Cisbio的 HTRF比值算法校正，此算法使用的是 665nm和620nm的荧光信号比值。 HTRF测定在SpectraMax M5e读板机上的 表现通过使用两种不同的HTRF检测试剂 展示。G-蛋白偶联受体信号转导通过检测 两种主要通路，cAMP的调控和IP3介导的 胞 内 钙 离 子 水 平 增 加 。 利 用 c A M P dynamic 2试剂中Eu的穴状化合物标记的 单克隆抗-cAMP抗体和d2-标记的cAMP进 行检测。 由细胞本身产生的cAMP与cAMP-d2竞争 结合抗-cAMP抗体穴状化合物。细胞内 cAMP的增加导致FRET降低，检测到的 665nm荧光下降了。IP-One测定采用相似 的方式并使用IP1特异的单克隆抗体，一 种稳定的在氯化锂存在下富集于信号转导细胞中的IP3下游代谢产物。665nm荧光 与IP1浓度在校准品或细胞裂解物中成反 比。这篇应用文献展示了两种基于细胞的 检测数据和由cAMP dynamic 2和IP-One 试剂盒得到的标准曲线。这些HTRF数据 揭示了在SpectraMax M5e读板机上得到 的完美动态范围和Z’因子。