不可否认，细胞株开发中单克隆性的保证是至关重要的，而这些细胞株可用来生产治疗药物（例如单克隆抗体或基于细胞的治疗方法）。如果没有明确的方法来追踪单细胞的克隆生长，那么简单地观察板孔中的克隆或使用单克隆性的置信水平，并不能构成单克隆性的充分证据。
我们最近与阿斯利康生物制药发展部的科学家 Gargi Roy 讨论了当前改进干细胞株工程的挑战和机遇。此前，Roy 和她的研究团队使用 ClonePix FL 从中国仓鼠卵巢( CHO )细胞中生产治疗性单克隆抗体[1]。当他们将重点转移到干细胞工程时，很明显尽管有单抗生产的共同点，但这两种工作流程存在差异。阿斯利康的干细胞治疗团队一直在进行干细胞工程和单克隆开发，此外，Roy 详细介绍了她的团队如何以更高的准确度培养单克隆细胞株。
干细胞工程
干细胞工程涉及将体细胞(除精子和卵细胞之外的任何生物细胞)或胚胎细胞转化为能够分化为所有细胞类型的干细胞。这种方法旨在开发各种细胞模型，用于疾病建模、个性化医疗、药物发现和基于干细胞的治疗，如单克隆抗体。
两种主要的干细胞工程方法如下:
1）诱导多能干细胞( iPSCs)：通过引入转录因子由体细胞转化而来。
2）胚胎干细胞 (ESCs )：来源于未分化的胚胎内细胞团。
这两种类型的干细胞共同点是可以利用它们产生单克隆抗体。此外，干细胞介导的单克隆抗体较重组单克隆抗体具有某些优势，例如会更好地渗透到病变区域和较高的血脑屏障( BBB )穿越率。[2].
.如何生产单克隆细胞株: 工作流程
无论您使用 iPSCs、ESC 或其他细胞类型，下面总结的基础工作流程适用于单克隆细胞株生产：
1） 单细胞分离：分离一个单细胞，开始克隆；
2） 细胞扩增和鉴定：形成克隆并评估单克隆性，通过运行基因型/表型分析确保您的细胞表达目的蛋白；
3） 克隆细胞株：细胞类型特异性分化。
单细胞分离和克隆生长面临的挑战
即使有更好的单细胞分离技术和单克隆工作流程，仍然有可能遇到一些挑战。Gargi Roy 团队想要在多个板子上分离细胞并形成具有相同特征的多个克隆时，主要的挑战就出现了。随着单细胞分离板数的增加，人们经常观察到克隆生长效率的稳定下降。在 ACF（ animal component-free ）条件时下降幅度更大，您需要考虑 ACF 的研究对您所在机构是否至关重要。
与 iPSCs 相比，ESCs 中克隆生长效率的差异更为突出，使用改造过的 ESCs 效率下降到了个位数。Roy 指出下降的主要原因是铺板过程中细胞存活率的下降，她还强调通过富集培养基来改善实验设计，尤其是在 ACF 条件下。
iPSCs和ESCs之间单细胞克隆生长效率的差异说明了ESCs的显著差异
即使有足够的克隆生长，也必须非常注意防止细胞凋亡，8-10 天的适时收取至关重要。细胞的聚集是阻碍单克隆性评估的另一个问题，您必须使用正确的解离试剂将细胞从孔表面彼此分离，这是下游分析的关键步骤。
单克隆细胞株开发过程中的困难
单克隆性的验证对细胞株的开发至关重要，您需要提供细胞群来源于单细胞的详细证据以供监管备案。Roy 的团队发现 ESCs 由于其粘性表面和不规则形状而特别难以监控，如果两个 ESCs 非常接近，则很可能将它们判定为单细胞。此外，如果您的时间很紧张，您可以对统计数据应用有限稀释法来计算单克隆性的可能性。
CloneSelect 单细胞分离系统和 CSI 细胞生长分析系统的联用不仅可在单细胞分离时证明单克隆性，并能在细胞沉积过程中轻松区分两个非常接近的细胞，还允许您追溯从收获当天到第 0 天的克隆以确保单克隆性，如下图所示。
使用 CloneSelect 单细胞分离系统和 CSI 细胞生长分析系统确认单克隆性并捕捉单细胞图像
克隆鉴定
细胞株开发的最后一部分是表征，一旦评估了单克隆性，您要确保这种单克隆性体现在基因型和多能性中，克隆中的细胞是否都具有一致的所需功能水平？更重要的是，它们在遗传上是否稳定，也就是说它们可以保存遗传物质并将其传至下一代？最后，它们是否具有多能性(即能否分化为三个主要胚层-外胚层、内胚层和中胚层)？只有通过高通量克隆筛选才能得到答案。
CSI 细胞生长分析系统包含无标签明场技术，可定制荧光成像，并配有高级数据分析工具，包括汇合度测定、生长曲线、单克隆性报告生成和板缩略图，以快速可视化每孔的克隆生长。凭借高分辨率和多种成像模式，您甚至可以检测克隆中细胞特有的细胞标记物，这使您可以确认您的单克隆细胞株是否具有所需的功能。
下图显示了单克隆 ESCs 分化为三个不同的胚层，每个胚层中带有各自的生物标记。
CloneSelect 细胞生长分析系统的功能评估范围将持续到开始细胞分化阶段之后，通过荧光成像，您可以监测细胞分化形成不同组织层的过程。
